Nghiên cứu phát triển quy trình định lượng tuyệt đối HCV bằng công nghệ digital PCR và đánh giá khả năng ứng dụng vào thực tế lâm sàng

Viêm gan virus C là một bệnh nhiễm do Hepatitis C Virus (HCV) gây ra. Bệnh tiến triển thầm lặng trong một thời gian dài (hơn 80% số ca mắc không xuất hiện triệu chứng bệnh) nên người bệnh không được chẩn đoán và điều trị kịp thời. Việc không điều trị đúng lúc có thể dẫn đến các biến chứng như xơ gan (khoảng 20 – 30% số bệnh nhân nhiễm HCV) hoặc nguy hiểm hơn là ung thư gan (khoảng 7% số bệnh nhân nhiễm HCV).

Tuy là một bệnh khá nguy hiểm nhưng cho đến nay chưa có vaccine phòng bệnh viêm gan virus C nên điều trị là phương thức duy nhất giúp ngăn ngừa việc lan truyền HCV trong cộng đồng cũng như đem lại những ích lợi cho sức khỏe của bệnh nhân. Trong điều trị bệnh viêm gan virus C, lượng HCV trong máu là yếu tố quan trọng phải được xác định trước khi điều trị vì ảnh hưởng quyết định đến phác đồ điều trị, thời gian điều trị và tiên lượng đáp ứng điều trị. Hiện nay, phương pháp realtime PCR (qPCR) là phương pháp phổ biến để định lượng virus, tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này là cần phải xây dựng đường chuẩn định lượng và kết quả định lượng có thể sai lệch so với thực tế do hiệu quả nhân bản các mẫu lâm sàng và các mẫu trong đường chuẩn định lượng khác nhau.

Phương pháp digital PCR là một phương pháp sinh học phân tử mới được phát triển gần đây, cho phép định lượng trực tiếp hàm lượng virus có trong mẫu bệnh phẩm mà không cần dựa vào đường chuẩn và có độ nhạy cao. Kỹ thuật này hiện có nhiều ứng dụng trong y sinh học như định lượng tuyệt đối, phát hiện các allele hiếm,…

Việt Nam là nước có tỷ lệ lưu hành HCV khá cao. Theo số liệu thống kê năm 2014, cả nước có 2,58 triệu người nhiễm HCV, chiếm 3% dân số. Trong khi thu nhập bình quân đầu người năm 2016 của Việt Nam chỉ đạt 2.200 USD/năm thì chi phí điều trị cho một ca bệnh HCV vào khoảng 10.000 – 18.000 USD cho mỗi phác đồ điều trị 48 tuần. Chẩn đoán sớm và chính xác lượng HCV trong cơ thể giúp giảm thời gian và chi phí điều trị cho mỗi ca bệnh, đồng thời có thể giảm thiểu khả năng lây nhiễm trong cộng đồng.

Đề tài nêu trên được thực hiện nhằm xây dựng một quy trình định lượng chính xác hàm lượng HCV trong mẫu dịch thể dựa trên kỹ thuật digital PCR có thể ứng dụng vào thực tiễn chẩn đoán bệnh và theo dõi quá trình điều trị bệnh viêm gan virus C.

Theo đó, nhóm nghiên cứu đã tạo thành công chứng dương AR-HCV và chứng nội AR-IC bằng công nghệ armored RNA với đặc tính bền với nuclease giúp làm tăng độ chính xác cho các phương pháp định lượng, được dùng cho xây dựng qui trình định lượng RNA HCV bằng digital PCR (dPCR). Nhóm cũng thiết kế mồi và mẫu dò đặc hiệu, xác định được nồng độ mồi và mẫu dò tối ưu, xây dựng được qui trình định lượng RNA HCV từ mẫu chứng dương AR-HCV và mẫu máu/huyết tương lâm sàng bằng dPCR.

Đánh giá chất lượng và hiệu quả sử dụng của qui trình định lượng HCV bằng dPCR xây dựng cho thấy, qui trình đạt các chỉ tiêu cơ sở, bao gồm: nhân bản và phát hiện chọn lọc cho HCV; giới hạn phát hiện của qui trình từ 27.9 copies/mL tới 1.45 x 10⁶ copies/mL. Qui trình đạt độ chính xác cao, với độ biến thiên nội phản ứng CV ≤ 1.47%, và độ biến thiên liên phản ứng CV ≤ 9.59%; bao phủ được các genotype HCV khác nhau; độ nhạy đạt 100%, độ đặc hiệu đạt 98%; cho kết quả định lượng RNA HCV trong các mẫu lâm sàng tương đương với kết quả định lượng đo bằng bộ kit chuẩn COBAS^® AmpliPrep/COBAS^® TaqMan^® HCV Quantitative v2.0 (Roche). Qui trình định lượng RNA HCV bằng dPCR do đề tài xây dựng phù hợp để chẩn đoán và theo dõi điều trị cho bệnh nhân viêm gan HCV.

Ngoài ra, đề tài cũng đánh giá tiềm năng áp dụng qui trình dPCR để định lượng chính xác và tuyệt đối HBV (virus viêm gan B), cho thấy khả năng ứng dụng của kỹ thuật này trong xét nghiệm định lượng chính xác HCV, HBV và các tác nhân gây bệnh khác.

Như vậy, với nhiệm vụ nghiên cứu nêu trên, nhóm tác giả đã phát triển một qui trình định lượng HCV dựa trên kỹ thuật digital PCR (dPCR) với nhiều ưu điểm so với kỹ thuật qPCR hiện hành như không cần dựng đường chuẩn định lượng, chứng dương và chứng nội cho qui trình được thiết kế dựa trên công nghệ AR (Armored RNA) có độ bền và đảm bảo độ ổn định. Đây là các ưu điểm giúp cho việc định lượng HCV bằng dPCR trở nên đơn giản, chính xác và hiệu quả. Việc thực hiện thành công qui trình này sẽ là công cụ hiệu quả hỗ trợ cho quá trình điều trị bệnh viêm gan C cũng như các bệnh do virus khác, đặc biệt trong bối cảnh chưa có nghiên cứu tương tự được tiến hành cho đến thời điểm hiện nay.

Bên cạnh đó, kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ là tiền đề cho việc phát triển các bộ kit cũng như dịch vụ chẩn đoán định lượng HCV và các bệnh truyền nhiễm khác do Việt Nam sản xuất. Các bộ kit cũng như các dịch vụ chẩn đoán do Việt Nam phát triển có chất lượng tương đương các bộ kit chẩn đoán của nước ngoài nhưng giá thành cạnh tranh hơn sẽ góp phần làm giảm sự phụ thuộc vào các bộ kit nước ngoài, đồng thời thúc đẩy các nghiên cứu dụng kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại trong chẩn đoán và hỗ trợ điều trị bệnh cho người.

Có thể tìm đọc toàn văn Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài tại Trung tâm Thông tin và Thống kê Khoa học và Công nghệ (CESTI).

Lam Vân (CESTI)